α-酮戊二酸脱氢酶（α-KGDH）活性测定试剂盒说明书

                                        微量法100管/96样

注   意 ：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。

测定原理：

α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD⁺ 和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、 二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：100mL×1瓶，-20℃保存；

试剂二：20mL×1瓶，-20℃保存；

试剂三：1.5mL×1支，-20℃保存；

试剂四：液体20mL×1瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1瓶，-20℃保存；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、   称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、   将匀浆600g，4℃离心5min。

3、   弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

4、   上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的α-KGDH（此步可选做）。

5、   在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体α-KGDH活性测定。

测定步骤：

1、  分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、  样本测定

（1）在试剂五中加入18mL试剂四充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min；现配现用；

（2）在试剂六中加入1mL蒸馏水，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本、10μL试剂六和180μL试剂五，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

α-KGDH活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

 α-KGDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

 α-KGDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T=325×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

α-KGDH活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.65×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T=650×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。

α-KGDH活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=1.3×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.01 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。